莫愁路堂是南京基督教建堂历史最早的教堂之一。清同治12年（1873）美国北长老会来南京传道，在汉西门四根杆子路（今莫愁路）建“四根杆子礼拜堂”。光绪10年（1884），建明德女子中学（今南京女子中等专业学校），内有小礼拜堂。光绪14年（1888），李满在明德女中东面建起一座正规的教堂，名为“耶稣会堂”，可容400人。

1927年，耶稣会堂改名为中华基督教会南京汉中堂，是江安大会南京区会所在地。1934年，四根杆子路拓宽为莫愁路，原汉中堂拆除。1936年，经鲍忠牧师筹款折合1100两黄金重建汉中堂。汉中堂属中西合璧的哥特式建筑，建筑面积746平方米，可容纳1000人，由当时金陵大学的校长陈裕光之弟陈裕华长老设计，基督将军冯玉祥题写奠基石“因为那立好了根基的就是耶稣基督”。张之江将军题写了“汉中堂”匾额。1937年12月13日，侵华日军制造了南京大屠杀惨案，当时汉中堂内设有难民收容所，掩护了许多难民免受日军的残害。

新中国成立后，1951年在汉中堂成立三自革新运动促进委员会支会，1954年汉中堂改名为莫愁路堂。1958年，教堂实行联合礼拜，该堂为南京市当时保留的四座教堂之一。

文革期间，教堂关闭并被外单位占用。1980年底复堂。1996年增设市基督教大楼的第三、四层为副堂，主、副堂可容1800人礼拜。

现在，莫愁路堂积极开展社会服务和公益事业，先后被评为区、市、省和谐教堂。莫愁路堂的主堂建筑更是被评为南京市优秀民国建筑和江苏省文物保护单位。并于2013年被评为全国和谐寺观教堂、2015年荣获“江苏省五星级宗教活动场所”的荣誉称号。